Mario: L'eroe. Questo personaggio avrà sicuramente un viso familiare a tutti i giocatori Nintendo ed è il personaggio principale del gioco.

Luigi: Il fratello di Mario. Potrà essere utilizzato nella modalità Due Giocatori.

Principessa Peach: La bionda principessa del Regno dei Funghi si è fatta rapire per l'ennesima volta e andrà salvata dal perfido Bowser e dai suoi scagnozzi.

Toad: Gli abitanti del Regno dei Funghi, fedeli alla Principessa Peach. Alcuni Toad gestiscono delle Case nelle quali si potranno ottenere delle vite extra o dei power-up.

Reznor: Dei dinosauri provenienti da Yoshi's Island, sono i boss delle fortezze che si trovano a metà dei primi sei mondi.

Bowserotti: Sono 7 e vi daranno del filo da torcere in quanto boss di ogni mondo e scagnozzi di Bowser (tranne nel Mondo 6 e nel Mondo Stella).

Bowser: Boss finale del gioco, andrà pero sconfitto una seconda volta nel Mondo Stella.