Mario: poteva forse mancare il grande eroe del Regno dei Funghi? Ovviamente no! Riuscirà ancora una volta a salvare la sua cara principessa?

Luigi: e se c’è Mario, può non esserci lui? Ovviamente no! Anche Luigi parte all’avventura per aiutare il suo fratellone a realizzare il suo scopo. Luigi è giocabile solo in multy, ma appare anche come Super Guida controllato dalla CPU.

Toad Giallo: per una volta anche il fedele servitore della principessa Peach darà un aiuto concreto ai Mario Bros. Toad Giallo è giocabile solo in multy.

Toad Blu: come il suo compare giallo, aiuterà i fratelli Mario nel salvataggio della principessa. Toad Blu è giocabile solo in multy.

Principessa Peach: l’amata sovrana del Regno dei Funghi. Si è fatta rapire per l’ennesima volta, riuscirà a ritornare al suo grande castello?

Yoshi: il tenero dinosauro ritorna per aiutare Mario & co! E’ in grado di mangiare quasi ogni tipo di nemico e di volare per brevissimo tempo. Sarà giocabile solo in livelli specifici e quindi purtroppo non si potrà tenerlo a lungo come in “Super Mario World”. Sono presenti quattro colorazioni di Yoshi: verde, giallo, celeste e rosa.

Toad: questo Toad è meno coraggioso dei suoi amici giallo e blu, ma darà comunque una mano con le sue casette disseminate in (quasi) tutti i mondi del gioco.

Bowserotti: Larry, Roy, Lemmy, Wendy, Iggy, Roy, Morton e Ludwig: questi sono i nomi dei sette figli di Bowser originali. Saranno i boss dei primi sette mondi di gioco, sia dei castelli che delle fortezze.

Kamek: uno dei servitori di Bowser più fedeli. All’inizio farà da supporto ai Bowserotti, ma in seguito scenderà in campo lui stesso contro Mario e i suoi amici.

Bowser Jr: il figlio prediletto di Bowser. Combatterà contro i nostri eroi solamente due volte, ma quelle battaglie saranno memorabili. E’ il comandante di una flotta di navi volanti.

Bowser: ecco il tremendo Re dei Koopas più agguerrito che mai! Anche stavolta il suo tentativo di rapimento è andato a segno, ma per quanto tempo durerà? Come al solito è lui il boss finale e la lotta contro di lui sarà a dir poco indimenticabile.