MARIO: Dopo essere stato salvato da suo fratello Luigi dai Boo, Mario decide di fare una vacanza a Delfinia insieme a Peach ed a dei Toad.

 PEACH: La principesse del Regno dei Funghi, calma e tranquilla, viene nuovamente rapita.

 TOAD: I funghetti, servitori di Peach.

 MASTRO TOAD: Il Toad più anziano di tutti. E' il maggiordomo di Peach.

 BOWSER JR.: Figlio di Bowser. Ha architettato un piano diabolico per conquistare il Regno dei Funghi: far arrestare Mario a Delfinia dopo averla vandalizzata.

 FUNGHI: far arrestare Mario a Delfinia dopo averla vandalizzata.

 PALMENSI: Gli abitanti dell'isola.

 NOKI: Gli abitanti della Baia. Recentemente si sono spostati per tutta l'isola.

 YOSHI: Una colonia di Yoshi vive a Girasolandia. Questi Yoshi non sopportano l'acqua e cambiano colore a secondo dei frutti che mangiano.

 PROFESSOR STRAMBIC: Anche se non appare personalmente, è l'inventore dello SPLAC e del pennello magico di Bowser Jr..

 SPLAC: L'aggeggio che Mario si porta sulle splalle. Sà parlare, ed aiuta Mario in più occasioni, oltre, ovviamente, a spruzzare acqua.

 I TANOOKI: Degli autentici strozzini, i tanooki sono ghiotti di Monete Blu. Oltre ai due di Delfinia, un terzo Tanooki abita nella Baia dei Noki, dimostrandosi amichevole nei confronti di Mario.