MARIO - C'è forse bisogno di presentazione? Mario è il nostro eroe, qui alle prese con la sua prima vera avventura! Il baffuto idraulico parte per salvare la principessa Peach, rapita da Bowser per la prima (ma di certo non ultima) volta. Dovrà correre, saltare, arrampicarsi, nuotare e affrontare i pericoli più svariati per portare a compimento questa missione!

 LUIGI - Il fratello di Mario, in questo gioco, differisce da quest'ultimo solo per i vestiti: rossi e neri per mario, bianchi e verdi per lui. Luigi ha una parte marginale nell'avventura, poichè entra in causa solo se è presente un secondo giocatore.

 
 TOAD - I servitori ufficiali della principessa fanno qui la loro prima comparsa. Sono 7, e ne troveremo uno alla fine di ogni fortezza (tranne che nell'ultima); la loro frase è rimasta scolpita nella mente di tutti i videogiocatori di vecchia data: "thank you, but our princess is in another castle!" (letteralmente: "grazie, ma la nostra principessa è in un altro castello")

 PRINCIPESSA PEACH - Ecco apparire per la prima volta anche la principessa Peach, qui chiamata Principessa Toadstool. Ella vi attende alla fine dell'ottava fortezza, per cui gambe in spalla!

 BOWSER - Il re dei koopa fa qui la sua prima apparizione, e stranamente presenta un look diverso da quello attuale (è senza capelli). Alla fine di ogni fortezza lo incontrerete, ma i primi 7 altro non sono che degli impostori: il vero Bowser vi aspetta solo nella ottava fortezza.