Nel gioco sono presenti 12 personaggi, ognuno con delle caratteristiche uniche rispetto agli altri. Vediamoli uno per uno:
 
MARIO: Sicuramente il personaggio Nintendo più famoso e amato. Il suo stile di combattimento è molto ben bilanciato e Mario non ha grandi punti deboli. I suoi attacchi speciali sono la classica Palla di Fuoco, il Super Pugno in Salto con cui colpisce l'avversario sparpagliando monete e il Tornado Mario.
 
LUIGI: Anche lui è sicuramente molto famoso, e la sua storia è pressappoco simile a quella del fratello. Anche lo stile di combattimento ha dei punti in comune: infatti i fratelli eseguono le stesse mosse, ma la Palla di Fuoco di Luigi viaggia verticalmente, il Super Salto in Pugno se eseguito bene causa un esplosione che scaglia via l'avversario e anche il Tornado Luigi funziona in modo diverso. Luigi è un personaggio segreto, per sbloccarlo bisogna finire il Target Test con gli 8 personaggi iniziali.
 
DONKEY KONG: Il celebre scimmione in passato rivale di Mario. E' il personaggio più pesante del gioco, quindi viene scagliato via difficilmente, però è anche piuttosto lento. I suoi attacchi sono molto potenti, come il Pugno Gigante che una volta caricato spazza via ogni nemico, la Manata che attacca a ripetizione e il Kong Rotante, perfetto per i recuperi.
 
LINK: Il protagonista della serie di Zelda. I suoi attacchi sono ottimamente bilanciati tra aerei, da terra, ravvicinati e a distanza, e Link può sfoderare due tra le sue armi più classiche, il Boomerang e le Bombe. L'Attacco Ciclone scaglia via i nemici ed è anche un ottimo metodo per tornare in campo dopo essere stato sbalzato via.
 
SAMUS: La protagonista della serie di Metroid: è una cacciatrice di taglie intergalattica in perenne lotta con i Pirati Spaziali. La corazza che indossa la rende pesante ma non eccessivamente lenta. Samus ha delle ottime mosse speciali, come il Colpo di Carica, le Bombe Morfosfera e il classico Attacco Screw, che può essere usato anche per i recuperi.
 
CAPITAN FALCON: Il personaggio più veloce del gioco, è il protagonista principale della serie di F-Zero. I suoi attacchi sono molto efficaci, anche se tutti a corto raggio. Il Pugno Falcon è una mossa di grande potenza, il Tuffo Falcon è utile per i recuperi e causa molti danni e il Calcio Falcon torna utile soprattutto a mezz'aria. Capitan Falcon è segreto e per sbloccarlo bisogna finire il 1P Mode in meno di venti minuti.
 
NESS: Questo ragazzino è il protagonista di Earthbound. Non è velocissimo ed ha dei salti molto lenti, ma può usare i suoi poteri psichici e la sua mazza da baseball. Lo Psico Fuoco è molto forte e può ingranare delle combo lunghissime, il Magnete PSI se usato contro Pikachu o altri personaggi che usano attacchi energetici può permettere a Ness di recuperare i danni subiti, lo Psico Tuono infine può essere guidato a distanza. Per sbloccare Ness, bisogna finire il 1P Mode con 3 vite a livello Normal senza usare Continue.
 
YOSHI: Il celebre sauro verde della saga di Mario è presente in questo picchiaduro, ed il suo stile di combattimento è basato sulle uova. Infatti può lanciare uova e trasformare l'avversario in un uovo per renderlo vulnerabile. Inoltre può usare il suo Schianto a Terra. Il secondo salto di Yoshi è altissimo, e questo compensa l'assenza di una mossa di recupero.
 
KIRBY: La famosissima palla rosa di HAL, può sfoderare i suoi classici movimenti come il volo, o il Risucchio con cui copia le abilità dell'avversario. Inoltre Kirby dispone della Sciabolata, utile anche per i recuperi, e della Roccia con cui si scaglia dall'alto verso il nemico e diventa una roccia. In questo stadio non può muoversi ma è invulnerabile.
 
FOX: Il protagonista della serie Starfox è veloce quasi quanto Capitan Falcon. Con la Pistola Laser può colpire a distanza e con il Riflettore è in grado di deflettere gli attacchi nemici. Il Fuoco Fox travolge gli avversari ed è utile anche per effettuare recuperi.
 
PIKACHU: Il più famoso dei Pokèmon. E'abbastanza veloce e ha dei buoni salti. I suoi attacchi sono basati sull'elettricità: con il Tuonoshock lancia piccole scariche di elettricità, con il Tuono richiama fulmini dal cielo e con l'Attacco Rapido può effettuare ottimi recuperi.
 
JIGGLYPUFF: Anche Jigglypuff è uno dei Pokémon più famosi e come Kirby può effettuare 5 salti. Anche se può sferrare un possente pugno, la Libbra, i suoi migliori attacchi sono il Canto con cui rende inermi gli avversari addormentandoli, e il Riposo con cui si addormenta ma travolge gli avversari con una luce bianca che irradia dal corpo. Jigglypuff non è disponibile dall'inizio, per averlo bisogna finire il 1P Mode.